中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 16294―2010代替GB/T 16294―1996

潔凈室（區(qū)）沉降菌技術(shù)要求與測試方法

Test method for settling microbe in clean room (zone) of the pharmaceutical industry

前 言

本標(biāo)準(zhǔn)參考了ISO 14698-1《潔凈間以及相關(guān)環(huán)境控制第1部分：微生物控制》，ISO/TS 11133-1：2000（英文版）《食品和動物飼料的微生物學(xué)培養(yǎng)基制備和生產(chǎn)指南第1部分：實驗室培養(yǎng)基制備的質(zhì)量保證通用指南》。

本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T 16294-1996《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）沉降菌的測試方法》。

本標(biāo)準(zhǔn)與GB/T 16294-1996的主要區(qū)別為：

―增加了確定最少采樣點數(shù)目的方法；

―修改了原標(biāo)準(zhǔn)4.8.3.2，改為“4.10.2采用大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）配制的培養(yǎng)皿經(jīng)采樣后，在30℃~35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，時間不少于2d，采用沙氏培養(yǎng)基（SDA）配制的培養(yǎng)皿經(jīng)采樣后，在20℃~25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，時間不少于5d。”；

―本標(biāo)準(zhǔn)增加了5.8“日常監(jiān)控”的內(nèi)容，增加了潔凈室（區(qū)）空氣微生物濃度控制的糾偏限度和警戒限度的設(shè)立和如何確定取樣頻次的內(nèi)容。

本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A、附錄B是規(guī)范性附錄。

本標(biāo)準(zhǔn)的附錄C是資料性附錄。

本標(biāo)準(zhǔn)由國家食品藥品監(jiān)督管理局提出并歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：上海市食品藥品包裝材料測試所、中國食品藥品檢定研究院醫(yī)療器械檢驗中心。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：陸維怡、徐敏鳳、馮曉明、王志敏。

本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次標(biāo)本發(fā)布情況為：GB/T 16294-1996。

潔凈室（區(qū)）沉降菌技術(shù)要求與測試方法

1 范 圍

 

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了醫(yī)藥工業(yè)潔凈室和潔凈區(qū)中沉降菌測試條件、測試方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于醫(yī)藥工業(yè)潔凈室和潔凈區(qū)，無菌室或局部空氣凈化區(qū)域（包括潔凈工作臺）的沉降菌的測試和環(huán)境的驗證。

2 規(guī)范性引用文件

 

下列文件中的條款通過本標(biāo)準(zhǔn)的引用而成為本標(biāo)準(zhǔn)的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內(nèi)容）或修訂版均不適用于本標(biāo)準(zhǔn)，然而，鼓勵根據(jù)本標(biāo)準(zhǔn)達(dá)成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

GB/T 16292-2010醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子的測試方法

3 術(shù)語和定義

 

下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

3.1沉降菌settling microbe

用本標(biāo)準(zhǔn)提及的方法收集空氣中的活微生物粒子，通過專門的培養(yǎng)基，在適宜的生長條件下繁殖到可見的菌落數(shù)。

3.2沉降菌菌落數(shù)settling microbe plate count

規(guī)定時間內(nèi)每個平板培養(yǎng)皿收集到空氣中沉降菌的數(shù)目，以個/皿表示。

4 測試方法

 

4.1方法提要

本測試方法采用沉降法，即通過自然沉降原理收集在空氣中的生物粒子于培養(yǎng)基平皿，經(jīng)若干時間，在適宜的條件下讓其繁殖到可見的菌落進(jìn)行計數(shù)，以平板培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)來判定潔凈環(huán)境內(nèi)的活微生物數(shù)，并以此來評定潔凈室（區(qū)）的潔凈度。

4.2人員的職責(zé)及培訓(xùn)

潔凈室（區(qū)）的測試人員應(yīng)進(jìn)行本專業(yè)的培訓(xùn)并獲得相應(yīng)資格后才能履行對潔凈室（區(qū)）測試的職責(zé)，其中包含涉及的衛(wèi)生知識和基本微生物知識。

潔凈室（區(qū)）的測試人員應(yīng)選與生產(chǎn)操作的空氣潔凈度級別要求相適應(yīng)的穿戴方式，外面的衣服不能帶進(jìn)100000級以上的區(qū)域。

4.3儀器

儀器應(yīng)包括：

a）培養(yǎng)皿；

b）培養(yǎng)基（見本標(biāo)準(zhǔn)附錄B）；

c）恒溫培養(yǎng)箱；

d）高壓蒸汽滅菌器。

4.3.1培養(yǎng)皿

一般采用φ90mm×15mm規(guī)格的培養(yǎng)皿。

4.3.2培養(yǎng)基

大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）或沙氏培養(yǎng)基（SDA）或其他用戶認(rèn)可并經(jīng)驗證了的培養(yǎng)基。其配制方法見附錄B。

4.3.3恒溫培養(yǎng)箱

必須定期對恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行校驗。

4.4測試步驟

4.4.1測試前培養(yǎng)基表面必須嚴(yán)格消毒。

4.4.2將已制備好的培養(yǎng)皿按采樣點布置圖逐個放置，然后從里到外逐個打開培養(yǎng)皿蓋，使培養(yǎng)基表面暴露在空氣中。

4.4.3靜態(tài)測試時，培養(yǎng)皿暴露時間為30min以上；動態(tài)測試時，培養(yǎng)皿暴露時間為不大于4h。

4.4.4全部采樣結(jié)束后，將培養(yǎng)皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4.4.5采用大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）配制的培養(yǎng)皿經(jīng)采樣后，在30℃~35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，時間不少于2d；采用沙氏培養(yǎng)基（SDA）配制的培養(yǎng)基經(jīng)采樣后，在20℃~25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，時間不少于5d。

4.4.6每批培養(yǎng)基應(yīng)有對照試驗，檢驗培養(yǎng)基本身是否污染?？擅颗x定3只培養(yǎng)皿作對照培養(yǎng)。

4.5菌落計數(shù)

4.5.1用肉眼對培養(yǎng)皿上所有的菌落直接計數(shù)、標(biāo)記或在菌落計數(shù)器上點計，然后用5~10倍放大鏡檢查，有否遺漏。

4.5.2若平板上有2個或2個以上的菌落重疊，可分辨時仍以2個或2個以上菌落計數(shù)。

4.6注意事項

4.6.1測試用具要作滅菌處理，以確保測試的可靠性、正確性。

4.6.2采取一切措施防止人為對樣本的污染。

4.6.3對培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及其他參數(shù)作詳細(xì)的記錄。

4.6.4由于細(xì)菌種類繁多，差別甚大，計數(shù)時一般用透射光于培養(yǎng)皿背面或正面仔細(xì)觀察，不要漏計培養(yǎng)皿邊緣生長的菌落，并須注意細(xì)菌菌落與培養(yǎng)基沉淀物的區(qū)別，必要時用顯微鏡鑒別。

4.6.5采樣前應(yīng)仔細(xì)檢查每個培養(yǎng)皿的質(zhì)量，如發(fā)現(xiàn)變質(zhì)、破損或污染的應(yīng)剔除。

5 測試規(guī)則

 

5.1測試條件

在測試之前，要對潔凈室（區(qū)）相關(guān)參數(shù)進(jìn)行預(yù)先測試，這類測試將會提供測試沉降菌的環(huán)境條件，例如：這種預(yù)先測試或可包括：

a）溫度和相對濕度的測試。潔凈室（區(qū)）的溫度和相對濕度應(yīng)與其生產(chǎn)及工藝要求相適應(yīng)（無特殊要求時，溫度在18℃~26℃，相對濕度在45%~65%為宜）。同時應(yīng)滿足測試儀器的使用范圍；

b）室內(nèi)送風(fēng)量或風(fēng)速的測試，或壓差的測試；

c）高效過濾器的泄漏測試。

5.2測試狀態(tài)

靜態(tài)和動態(tài)兩種狀態(tài)均可進(jìn)行測試。

靜態(tài)測試時，室內(nèi)測試人員不得多于2人。

沉降菌測試前，被測潔凈室（區(qū)）由使用者決定是否需要預(yù)先消毒。

測試報告中應(yīng)標(biāo)明測試時所采用的狀態(tài)和室內(nèi)測試人員數(shù)。

5.3測試時間

5.3.1在空態(tài)或靜態(tài)a測試時，對單向流潔凈室（區(qū)）而言，測試宜在凈化空氣調(diào)節(jié)系統(tǒng)正常運(yùn)行時間不少于10min后開始。對非單向流潔凈室（區(qū)），測試宜在凈化空氣調(diào)節(jié)系統(tǒng)正常運(yùn)行時間不少于30min后開始。在靜態(tài)b測試時，對單向流潔凈室（區(qū)），測試宜在生產(chǎn)操作人員撤離現(xiàn)場并經(jīng)過10min自凈后開始；對非單向流潔凈室（區(qū)），測試宜在生產(chǎn)操作人員撤離現(xiàn)場并經(jīng)過20min自凈后開始。(原文鏈接：http://www.iwuchen.com/a-63/)

5.3.2在動態(tài)測試時，則須記錄生產(chǎn)開始的時間以及測試時間。

5.4沉降菌菌落數(shù)計算

5.4.1采樣點數(shù)量及其布置

5.4.1.1最少采樣點數(shù)目

沉降菌測試的最少采樣點數(shù)目可參照GB/T 16292-2010。

5.4.1.2采樣點的位置

沉降菌的采樣點位置可參照GB/T 16292-2010。

a）工作區(qū)采樣點位置離地0.8m~1.5m左右（略高于工作面）；

b）可在關(guān)鍵設(shè)備或關(guān)鍵工作活動范圍處增加測點。

采樣點布置的規(guī)則見附錄A。

5.4.2最少培養(yǎng)皿數(shù)

在滿足最少采樣點數(shù)目的同時，還宜滿足最少培養(yǎng)皿數(shù)，見表1。

表1最少培養(yǎng)皿數(shù)

5.4.3采樣次數(shù)

每個采樣點一般采樣一次。

5.4.4采樣注意事項

5.4.4.1對于單向流潔凈室（區(qū)）或送風(fēng)口，采樣器采樣口朝向應(yīng)正對氣流方向；對于非單向流潔凈室（區(qū)），采樣口向上。

5.4.4.2布置采樣點時，至少應(yīng)盡量避開塵粒較集中的回風(fēng)口。

5.4.4.3采樣時，測試人員應(yīng)站在采樣口的下風(fēng)側(cè)，并盡量少走動。

5.4.4.4應(yīng)采取一切措施防止采樣過程的污染和其他可能對樣本的污染。

5.4.4.5培養(yǎng)皿在用于檢測時，為避免培養(yǎng)皿運(yùn)輸或搬動過程造成的影響，宜同時進(jìn)行對照試驗，每次或每個區(qū)域取1個對照皿，與采樣皿同法操作但不需暴露采樣，然后與采樣后的培養(yǎng)皿（TSA或SDA)一起放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，結(jié)果應(yīng)無菌落生長。

5.5記錄

測試報告應(yīng)包含以下內(nèi)容：

a）測試者的名稱和地址，測試日期；

b）測試依據(jù)；

c）被測潔凈室（區(qū)）的平面位置（必要時標(biāo)注相鄰區(qū)域的平面位置）；

d）有關(guān)測試儀器及其測試方法的描述：包括測試環(huán)境條件，采樣點數(shù)目以及布置圖，測試次數(shù)，或可能存在的測試方法的變更，測試儀器的檢定證書等；若為動態(tài)測試，則還應(yīng)記錄現(xiàn)場操作人員數(shù)量及位置，現(xiàn)場設(shè)備運(yùn)轉(zhuǎn)數(shù)量及位置等；

e）測試結(jié)果；包括所有統(tǒng)計計算資料。

5.6結(jié)果計算

5.6.1用計數(shù)方法得出各個培養(yǎng)皿的菌落數(shù)。

5.6.2每個測點的沉降菌平均菌落數(shù)的計算，見式（1）。

5.7結(jié)果評定

5.7.1每個測點的沉降菌平均菌落數(shù)必須低于所選定評定標(biāo)準(zhǔn)中的界限。

5.7.2在靜態(tài)測試時，若某測點的沉降菌平均菌落數(shù)超過評定標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)重新采樣兩次，兩次測試結(jié)果均合格才能判為符合。

5.8日常監(jiān)控

對于沉降菌的監(jiān)控，宜設(shè)定糾偏限度和警戒限度，以保證潔凈室（區(qū)）的微生物濃度受到控制。應(yīng)定期檢測以檢查微生物負(fù)荷以及消毒劑的效力，并作傾向分析。靜態(tài)和動態(tài)的監(jiān)控都可以采用該方法。

對于沉降菌的取樣頻次，如果出現(xiàn)下列情況應(yīng)考慮修改，在評估以下情況后，也應(yīng)確定其他項目的檢測頻次：

―連續(xù)超過糾偏限度和警戒限度；

―停工時間比預(yù)計延長；

―關(guān)鍵區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)有污染存在；

―在生產(chǎn)期間，空氣凈化系統(tǒng)進(jìn)行任何重大的維修；

―日常操作記錄反映出傾向性的數(shù)據(jù)；

―消毒規(guī)程的改變；

―引起生物污染的事故等；

―當(dāng)生產(chǎn)設(shè)備有重大維修或增加設(shè)備時；

―當(dāng)潔凈室（區(qū)）結(jié)構(gòu)或區(qū)域分布有重大變動時。

 

附錄A（規(guī)范性附錄）潔凈室（區(qū)）采樣點布置

A.l潔凈室（區(qū)）采樣點布置宜力求均勻，避免采樣點在局部區(qū)域過于稀疏。下列多點采樣的采樣點布置圖示可作參考（見圖A.1）。

圖A.1平面采樣點布置圖

 

A.2 100級單向流區(qū)域，潔凈工作臺或局部空氣凈化設(shè)施的采樣點宜布置在正對氣流方向的工作面上，氣流形式可參考圖A.2、圖A.3。

 

附錄B（規(guī)范性附錄）培養(yǎng)基的滅菌及準(zhǔn)備

B.1大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）培養(yǎng)基的滅菌及準(zhǔn)備

B.1.1培養(yǎng)基采用大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基，可以按以下處方制備，也可使用按該處方生產(chǎn)的符合要求的脫水培養(yǎng)基。配制后按培養(yǎng)基規(guī)定的經(jīng)驗證合格的滅菌程序滅菌。

B.1.2大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基配方

酪蛋白胰酶消化物……………………………………………………15g

大豆粉木瓜蛋白酶消化物……………………………………………5g

氯化鈉…………………………………………………………………5g

瓊脂……………………………………………………………………15g

純化水……………………………………………………………1000mL

取上述成分除瓊脂，混合，微熱溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為7.3±0.2，加入瓊脂，加熱融化后，分裝，滅菌，冷卻至約60℃，在無菌操作要求下傾注約20mL至無菌平皿（φ90mml))中。加蓋后在室溫放至凝固。

 

B.2沙氏瓊脂培養(yǎng)基（SDA）培養(yǎng)基的滅菌及準(zhǔn)備

萄萄糖………………………………………………………………40g

酪蛋白胰酶消化物、動物組織的胃酶消化物等量混合…………10g

瓊脂…………………………………………………………………15g

純化水…………………………………………………………1000mL

取上述成分除瓊脂，混合，微熱溶解，調(diào)節(jié)pH值使滅菌后為5.6±0.2，加入瓊脂，加熱融化后，分裝，滅菌，冷卻至約60℃，在無菌操作要求下傾注約20mL至無菌平皿（φ90mml))中。加蓋后在室溫放至凝固。

 

B.3培養(yǎng)基平皿培養(yǎng)及保存

制備好的培養(yǎng)基平皿宜在2℃~8℃保存，一般以一周為宜或按廠商提供的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。采用適宜方法在平皿上做好培養(yǎng)基的名稱、制備日期記錄的標(biāo)記。

注1）：如采用其他規(guī)格的平皿，可適當(dāng)增減培養(yǎng)基的量，使之在平皿中形成至少2mm厚的瓊脂層。

 

附錄C（資料性附錄）潔凈室（區(qū)）沉降菌技術(shù)要求

潔凈室（區(qū)）沉降菌技術(shù)要求

相近標(biāo)準(zhǔn)：醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子的測試方法(GB_T 16292―2010)全文完整版 http://www.iwuchen.com/a-62/